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一、實驗目的

在疫情應急期間，細胞水平評價克咳膠囊藥粉抗SARS-CoV-2效果。

二、實驗材料：

1.受試藥物：1種，克咳膠囊藥粉。

2. 細胞：Vero E6細胞，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所病原中心保存。

3. 病毒：SARS-CoV-2，滴度為10⁵TCID₅₀/ml，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所病原中心-80℃保存。使用病毒滴度為100TCID₅₀。

三、實驗方法：

（一）樣品準備

1.     受試藥物：  

藥物名稱：克咳膠囊

藥物濃度：/   （委托方指定濃度，本報告僅對送檢樣本負責）

藥物生產(chǎn)廠家：貴州益佰制藥股份有限公司

藥物批號：/

藥物生產(chǎn)日期：/

藥物有效期：/

（二）受試藥物細胞毒性實驗

（1）   無菌96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl濃度為5×10⁴cell/ml Vero E6細胞，37℃ 5% CO₂培養(yǎng)24小時；

（2）   藥物用DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）分別倍比系列稀釋，原倍，1:2，1:4……1:128共8個稀釋度；

（3）   棄去96孔培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)液，分別加入稀釋好的藥物，每孔100μl，每濃度4個復孔，每孔再加入100μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）；

（4）   同時設立細胞對照：每孔200μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）加入至長成單層的Vero E6細胞96孔培養(yǎng)板中，共4個復孔。

（5）   37℃ 5％CO₂孵箱孵育3天；

（6）   光學顯微鏡下觀察細胞病變（CPE），細胞有CPE變化記為“+”，細胞無CPE變化或正常細胞形態(tài)記為“-”。

（三）受試藥物抗病毒實驗

（1）無菌96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl濃度為5×10⁴cell/ml Vero E6細胞，37℃ 5%CO₂培養(yǎng)24小時；

（2）受試藥物稀釋成5個濃度，每個濃度4個復孔，每孔100μl，然后每孔再加入等體積100 TCID₅₀病毒，37℃，5% CO₂孵箱作用1h；

（3）1h后，棄去96孔培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)液，加入上述混合液；

（4）同時設立細胞對照、病毒對照；

細胞對照：每孔200μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）加入至長成單層的Vero E6細胞96孔培養(yǎng)板中，共4個復孔。

病毒對照：每孔100μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶），再加入等體積100 TCID₅₀病毒，共4個復孔，37℃作用1h，1h后棄去96孔培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)液，加入上述病毒液。

（5）細胞37℃，5% CO₂孵箱孵育4-5天；

（6）光學顯微鏡下觀察細胞病變（CPE），細胞有CPE變化記為“+”，細胞無CPE變化或正常細胞形態(tài)記為“-”。

（四）實驗條件：以上實驗操作均在BSL-3實驗室內(nèi)完成。

（五）藥物效果計算：

1. 藥物對細胞半數(shù)毒性濃度(CC₅₀)的計算：

CC₅₀ = Antilog(D + × C)

A: 大于50%細胞病變率的百分數(shù)，B:小于50%細胞病變率的百分數(shù)，C: log(稀釋倍數(shù))，D: log(小于50%細胞病變率所對應的藥物濃度)

2. 藥物抑制病毒百分率：

藥物抑制病毒百分率% =  ×100%

3. 藥物抑制病毒半數(shù)有效濃度(EC₅₀)

EC₅₀ = Antilog(D+     ×C)

A: 大于50%抑制率的百分數(shù)，B: 小于50%抑制率的百分數(shù)，C: log(稀釋倍數(shù))，D: log(小于50%抑制率所對應的藥物濃度)

如藥物無抑制病毒作用將無法測得EC_50.

4. 選擇指數(shù)(SI)

SI   = 

（六）藥效評價指標：

選擇指數(shù)（Selection Index，SI）：指藥物對細胞50％毒性濃度與對病毒50％抑制濃度的比值(CC₅₀/EC₅₀)，或者表示藥物對細胞最大無毒濃度與對病毒最小有效濃度的比值(CC₀/EC₀)。選擇指數(shù)越大安全性越高。

四、實驗結(jié)果：

（一）受試藥物細胞毒性實驗

藥物分別設置8個濃度，細胞毒性測定結(jié)果顯示受試物在2000μg/mL及以上濃度對細胞有毒性，結(jié)果見表 1，根據(jù)藥物毒性CC₅₀計算公式，得出CC₅₀=1412.54μg/mL。

表1. 藥物毒性結(jié)果

“+”為細胞有CPE變化，“-”為細胞無CPE變化或正常細胞形態(tài)。

（二）受試藥物抗病毒實驗

       藥物分別設置5個濃度，受試藥物5個濃度在細胞上均無對病毒抑制效果，見表2，未測得EC₅₀。

表2. 藥物抗SARS-CoV-2效果

“+”為細胞有CPE變化，“-”為細胞無CPE變化或正常細胞形態(tài)，“/”為細胞細胞毒性

五、結(jié)論：

        根據(jù)細胞水平的篩選結(jié)果，計算克咳膠囊藥粉的CC₅₀為1412.54μg/mL，該受試物在1000μg/mL濃度及以下時，對SARS-CoV-2病毒均無抑制作用。體外實驗未獲得EC₅₀。