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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

在疫情應(yīng)急期間，細(xì)胞水平評(píng)價(jià)克咳膠囊藥粉抗SARS-CoV-2效果。

二、實(shí)驗(yàn)材料：

1.受試藥物：1種，克咳膠囊藥粉。

2. 細(xì)胞：Vero E6細(xì)胞，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病原中心保存。

3. 病毒：SARS-CoV-2，滴度為10⁵TCID₅₀/ml，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病原中心-80℃保存。使用病毒滴度為100TCID₅₀。

三、實(shí)驗(yàn)方法：

（一）樣品準(zhǔn)備

1.     受試藥物：  

藥物名稱：克咳膠囊

藥物濃度：/   （委托方指定濃度，本報(bào)告僅對(duì)送檢樣本負(fù)責(zé)）

藥物生產(chǎn)廠家：貴州益佰制藥股份有限公司

藥物批號(hào)：/

藥物生產(chǎn)日期：/

藥物有效期：/

（二）受試藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

（1）   無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl濃度為5×10⁴cell/ml Vero E6細(xì)胞，37℃ 5% CO₂培養(yǎng)24小時(shí)；

（2）   藥物用DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）分別倍比系列稀釋，原倍，1:2，1:4……1:128共8個(gè)稀釋度；

（3）   棄去96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入稀釋好的藥物，每孔100μl，每濃度4個(gè)復(fù)孔，每孔再加入100μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）；

（4）   同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照：每孔200μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）加入至長(zhǎng)成單層的Vero E6細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，共4個(gè)復(fù)孔。

（5）   37℃ 5％CO₂孵箱孵育3天；

（6）   光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變（CPE），細(xì)胞有CPE變化記為“+”，細(xì)胞無(wú)CPE變化或正常細(xì)胞形態(tài)記為“-”。

（三）受試藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)

（1）無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl濃度為5×10⁴cell/ml Vero E6細(xì)胞，37℃ 5%CO₂培養(yǎng)24小時(shí)；

（2）受試藥物稀釋成5個(gè)濃度，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，每孔100μl，然后每孔再加入等體積100 TCID₅₀病毒，37℃，5% CO₂孵箱作用1h；

（3）1h后，棄去96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，加入上述混合液；

（4）同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照；

細(xì)胞對(duì)照：每孔200μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶）加入至長(zhǎng)成單層的Vero E6細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，共4個(gè)復(fù)孔。

病毒對(duì)照：每孔100μl DMEM培養(yǎng)基（含2%雙抗和16μg/ml胰蛋白酶），再加入等體積100 TCID₅₀病毒，共4個(gè)復(fù)孔，37℃作用1h，1h后棄去96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，加入上述病毒液。

（5）細(xì)胞37℃，5% CO₂孵箱孵育4-5天；

（6）光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變（CPE），細(xì)胞有CPE變化記為“+”，細(xì)胞無(wú)CPE變化或正常細(xì)胞形態(tài)記為“-”。

（四）實(shí)驗(yàn)條件：以上實(shí)驗(yàn)操作均在BSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

（五）藥物效果計(jì)算：

1. 藥物對(duì)細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(CC₅₀)的計(jì)算：

CC₅₀ = Antilog(D + × C)

A: 大于50%細(xì)胞病變率的百分?jǐn)?shù)，B:小于50%細(xì)胞病變率的百分?jǐn)?shù)，C: log(稀釋倍數(shù))，D: log(小于50%細(xì)胞病變率所對(duì)應(yīng)的藥物濃度)

2. 藥物抑制病毒百分率：

藥物抑制病毒百分率% =  ×100%

3. 藥物抑制病毒半數(shù)有效濃度(EC₅₀)

EC₅₀ = Antilog(D+     ×C)

A: 大于50%抑制率的百分?jǐn)?shù)，B: 小于50%抑制率的百分?jǐn)?shù)，C: log(稀釋倍數(shù))，D: log(小于50%抑制率所對(duì)應(yīng)的藥物濃度)

如藥物無(wú)抑制病毒作用將無(wú)法測(cè)得EC_50.

4. 選擇指數(shù)(SI)

SI   = 

（六）藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)：

選擇指數(shù)（Selection Index，SI）：指藥物對(duì)細(xì)胞50％毒性濃度與對(duì)病毒50％抑制濃度的比值(CC₅₀/EC₅₀)，或者表示藥物對(duì)細(xì)胞最大無(wú)毒濃度與對(duì)病毒最小有效濃度的比值(CC₀/EC₀)。選擇指數(shù)越大安全性越高。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

（一）受試藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

藥物分別設(shè)置8個(gè)濃度，細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果顯示受試物在2000μg/mL及以上濃度對(duì)細(xì)胞有毒性，結(jié)果見表 1，根據(jù)藥物毒性CC₅₀計(jì)算公式，得出CC₅₀=1412.54μg/mL。

表1. 藥物毒性結(jié)果

“+”為細(xì)胞有CPE變化，“-”為細(xì)胞無(wú)CPE變化或正常細(xì)胞形態(tài)。

（二）受試藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)

       藥物分別設(shè)置5個(gè)濃度，受試藥物5個(gè)濃度在細(xì)胞上均無(wú)對(duì)病毒抑制效果，見表2，未測(cè)得EC₅₀。

表2. 藥物抗SARS-CoV-2效果

“+”為細(xì)胞有CPE變化，“-”為細(xì)胞無(wú)CPE變化或正常細(xì)胞形態(tài)，“/”為細(xì)胞細(xì)胞毒性

五、結(jié)論：

        根據(jù)細(xì)胞水平的篩選結(jié)果，計(jì)算克咳膠囊藥粉的CC₅₀為1412.54μg/mL，該受試物在1000μg/mL濃度及以下時(shí)，對(duì)SARS-CoV-2病毒均無(wú)抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)未獲得EC₅₀。